O roli badań dyfuzji cząsteczek koloidowych było już trochę w dziale "historia". Dwie zasadnicze techniki, którymi posługujemy się w Zakładzie do pomiarów współczynników dyfuzji to spektroskopia korelacji fotonów (PCS - z ang. Photon Correlation Spectroscopy) oraz spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS - z ang. Fluorescence Correlation Spectroscopy). PCS mierzy tzw. dyfuzję kolektywną lub chemiczną, a FCS - tzw. dyfuzję własną (zwaną też "śledzoną").
Dyfuzja kolektywna jest zjawiskiem nierównowagowym obserwowanym wtedy, gdy wytworzony zostaje gradient stężenia badanej substancji. Polega na powstaniu ukierunkowanego strumienia tej substancji, niwelującego powstały gradient. Ilościowo po raz pierwszy opisał to Adolf Fick w 1855 r. (prawa Ficka). Dyfuzja kolektywna zawsze dotyczy znacznej liczby cząsteczek tak, by sens było mówić o stężeniu i jego gradientach.
Dyfuzja własna jest zjawiskiem równowagowym, polegającym na przypadkowym błądzeniu nawet pojedynczej cząsteczki badanej substancji, Nie jest wymagany żaden gradient stężenia. Co więcej, dyfuzja własna opisuje zawsze zachowanie pojedynczej cząsteczki. Zazwyczaj współczynnik dyfuzji własnej otrzymuje się z pomiaru średniokwadratowego przesunięcia w funkcji czasu jako nachylenie tej zależności z dokładnością do stałego współczynnika.
PCS
Stosunkowo prosto i elegancko PCS można opisać jako częściową dyfrakcję światła na periodycznych fluktuacjach stężenia. Ruchy cieplne cząsteczek rozpuszczalnika wywołują fluktuacje stężenia cząsteczek koloidu. Zgodnie z twierdzeniem Fouriera, fluktuacje te można rozłożyć na szereg niezależnych od siebie fluktuacji periodycznych o rosnących częstotliwościach (długościach fali).
Wybór kąta rozpraszania \(\theta\), poprzez warunek Bragga wyznacza składową Fouriera uczestniczącą w procesie dyfrakcji. Interpretacja zjawiska wygląda następująco: Fluktuacja periodyczna o długości fali \(d\) działa jak półprzezroczysta siatka dyfrakcyjna, która ugina częściowo falę padającą. Z prawa Ficka wynika, że fluktuacja taka zanika wykładniczo z czasem relaksacji proporcjonalnym do \(d^2\), a odwrotnie do współczynnika dyfuzji kolektywnej (chemicznej) \(D_c\). Ze względu na relację między wektorem rozpraszania \(q\) i stałą siatki \(d\), czas relaksacji \(\tau\) można wyrazić poprzez \(q\) i \(D_c\): \(\tau=\frac{1}{D_c q^2}\).
Ponieważ akty termicznego wzbudzenia zachodzą w przypadkowych odstępach czasu i ze zmiennymi amplitudami, do analizy sygnału natężenia światła rozproszonego używa się funkcji korelacji, która z pozornie chaotycznego sygnału uwypukla powtarzającą się wykładniczo zanikającą zależność sygnału od czasu po aktywacji fluktuacji. Z czasu zaniku funkcji korelacji oblicza się współczynnik dyfuzji \(D_c\), którego wartość używana jest do oszacowania promienia hydrodynamicznego \(r_h\) cząsteczki i/lub siły oddziaływań między cząsteczkami koloidu. W przypadku najprostszego liniowego przybliżenia wirialnego ekstrapolowana do zerowego stężenia wartość \(D_c\) podstawiana jest do wzoru Einsteina-Stokesa w celu obliczenia wartości \(r_h\), natomiast nachylenie zależności \(D_c(c)\) jest miarą siły oddziaływań międzycząsteczkowych.
Nasza aparatura do pomiarów techniką PCS wymieniona jest w zakładce "Aparatura". Z posiadanych elementów możemy "poskładać" kilka zestawów. Nasz reprezentacyjny układ obejmuje profesjonalny laser jednomodowy, goniometr firmy ALV oraz korelator ALV 7000 z oprogramowaniem do rejestrowania i analizowania funkcji korelacji. Można kontrolować temperaturę próbki w zakresie 10 - 50 C. Pozostałe zestawy można budować wokół kriostatów, grzejników lub komórki wysokociśnieniowej (do 200 MPa) bazując na korelatorach firmy ALV oraz Correlator.com.
Poniżej zamieszczamy schemat prostego układu do pomiarów PCS, jaki w zasadzie można zbudować samemu w domu, wraz z algorytmem postępowania.
Zamiast lasera "naukowego" można użyć wskaźnika laserowego. W roli próbki dobrze się sprawdza mleko homogenizowane. Grubość warstwy płynu i jego stężenie powinny być tak dobrane, by wiązka swobodnie przeszła przez próbkę. Aby nie narazić kamery na prześwietlenie wiązkę przechodzącą warto zablokować małym czarnym przedmiotem. U nas tę rolę pełniła zakrętka od fiolki. Na ekran najlepiej nadaje się kalka techniczna.
Po zaciemnieniu pomieszczenia na ekranie powinien pojawić się następujący obraz:
Najlepiej filmować go od tylnej strony ekranu (stąd przewaga kalki nad papierem). Widoczne na fotografii plamki zmieniają swoją jasność. Każda z nich jest obrazem dyfrakcyjnym powstałym na sinusoidalnej fluktuacji stężenia koloidu o okresie \(d\)równym \(d = 2 \pi/q\) i orientacji wyznaczonej przez położenie plamki względem osi optycznej. Zmiany jasności pojedynczych plamek, zarejestrowane w czasie 200 s pokazane są na poniższym wykresie. Plamki różniła odległość od osi optycznej (50, 100 i 150 pikseli).
Widać, że plamki bliskie centrum, którym odpowiada małą wartość \(q\), a więc duża wartość \(d\) zmieniają jasność znacznie wolniej, niż te bardziej oddalone (mniejsza wartość \(d\)). Jest to zrozumiałe, ponieważ powstanie (i zanik) fluktuacji o większym zasięgu przestrzennym wymaga większego przemieszczenia cząsteczek, a to musi zabierać więcej czasu.
Dla każdego z punktów leżących w jednakowej odległości od centrum wielkość \(q\) wektora rozpraszania jest taka sama, a więc próbkowane są fluktuacje o takim samym okresie \(d=2 \pi / q\). Dzięki temu funkcje korelacji obliczone dla sygnałów pochodzących z punktów leżących na okręgu (np. pomiędzy zielonymi liniami na rysunku powyżej) można uśrednić. Wyniki takiej procedury przedstawia poniższy wykres.
Cienkie linie odnoszą się do funkcji korelacji obliczonych z sygnałów zmierzonych w poszczególnych pikselach, natomiast gruba czarna linia to ich średnia. Widoczna na jej tle czerwona linia to funkcja wykładnicza dopasowana do tej średniej.
Taką procedurę uśredniania należy wykonać dla każdej dostępnej wartości \(q\), a więc dla każdego okręgu (lub jego fragmentu) zawierającego sygnał światłą rozproszonego. Uśrednione funkcje korelacji pokazuje poniższy rysunek.
Funkcje korelacji uśrednione wzdłuż okręgów o promieniach podanych w legendzie wykresu (wyrażone w pikselach). Z dopasowania funkcji wykładniczych otrzymuje się czasy korelacji \(\tau\). Zależność czasu korelacji od przestrzennego okresu fluktuacji \(d\) pokazuje poniższy rysunek.
Ponieważ oczekiwaną z praw Ficka zależnością jest proporcjonalność \(\tau \propto d^2\), na osi \(x\) mamy \(d^2\). Współczynnik nachylenia obserwowanej liniowej zależności jest równy \(\frac{1}{4 \pi^2 D_c}\), gdzie \(D_c\) jest współczynnikiem dyfuzji kolektywnej (chemicznej).
FCS
Dzięki temu, że optymalne warunki dla pomiaru FCS mają miejsce w ognisku skupionej przez obiektyw wiązki lasera, minimalna objętość próbki redukuje się do pojedynczych mikrolitrów, co doceniane jest zawsze tam, gdzie cena preparatu jest istotnym czynnikiem. Dodatkowo, optymalnym stężeniem jest wartość ok. 10 nM, co dla niewielkich fluoroforów jest stężeniem niemal homeopatycznym. O samej technice i jej zastosowaniach dość dobrze pisze Wikipedia
Nasz instrument to ConfoCor2 firmy Zeiss, zakupiony w 2001 r. Jak na swoje czasy był aparatem bardzo nowoczesnym (pierwszy komercyjny dwukanałowy instrument FCS). Pomimo upływu czasu w zasadzie nie odbiega możliwościami od instrumentów sprzedawanych współcześnie, zarówno pod względem optyki (lasery, objektywy, jakość ogniska) jak i elektroniki (detektory - fotodiody lawinowe i korelator cyfrowy).
Zajmujemy się głównie pomiarami współczynnika dyfuzji barwników oraz cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. Pomiary te wykonujemy w warunkach "normalnych", ale również w funkcji temperatury, wykorzystując specjalnie dostosowaną komórkę firmy Linkam, oraz w funkcji ciśnienia, korzystając z komórki wykonanej w Forschungszentrum Juelich (dr Gerd Meier). W przypadku próbek, w których dochodzi do reakcji chemicznej modyfikującej wydajność świecenia fluoroforu staramy się wyznaczyć szybkość reakcji i stałą równowagi. Chociaż tego rodzaju badanie zostało opisane w pierwszej pracy poświęconej FCS, interpretacja jego wyników wciąż pozostaje dużym wyzwaniem ze względu na skomplikowaną postać funkcji korelacji.